流式細胞儀是怎么運行的
流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的??偟倪^程是:由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴,根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選,而后由充電電路對選定細胞液滴充電,帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn),落入收集器中;其它液體被當作廢液抽吸掉,某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約數(shù)百μm。實驗經(jīng)驗公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度,d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度,可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。
充電電壓一般選+150V,或-150V;偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的,因此從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間,一般為數(shù)十ms。測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵,儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲??筛鶕?jù)具體要求予以適當調(diào)整。(50)數(shù)據(jù)處理原理:FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析,至于對儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。①數(shù)據(jù)顯示:FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖、二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。
直方圖是一維數(shù)據(jù)用作的圖形顯示形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析,形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同,坐標可以是線性標度或?qū)?shù)標度,用“道數(shù)”來表示,實質(zhì)上是所測的熒光或散射光的強度。坐標一般表示的是細胞的相對數(shù)。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個參數(shù)與細胞之間的關(guān)系是它的局限性。二維點圖能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系。坐標和坐標分別為與細胞有關(guān)的兩個獨立參數(shù),平面上每一個點表示同時具有相應(yīng)坐標值的細胞存在(圖10-3)。
可以由二維點圖得到兩個一維直方圖,但是由于兼并現(xiàn)象存在,二維點圖的信息量要大于二個一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細胞具有相同的二維坐標在圖上只表現(xiàn)為一個點,這樣對細胞點密集的地方就難于顯示它的精細結(jié)構(gòu)。經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。光電倍增管(PMT)為常用。PMT的響應(yīng)時間短,僅為ns數(shù)量級;光譜響應(yīng)特性好,在200~900nm的光譜區(qū),光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續(xù)調(diào)節(jié) ,因此對弱光測量十分有利。
光電管運行時特別要注意穩(wěn)定性問題,工作電壓要十分穩(wěn)定,工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W;陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應(yīng)處理,并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT,因為光譜響應(yīng)特性不同,不宜互換。也有用硅光電二極管的,它在強光下穩(wěn)定性比PMT好。從PMT輸出的電信號仍然較弱,需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。
流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關(guān)系,稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號,例DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器,輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群,它們的熒光強度相差1~2個數(shù)量級;而且在多色免疫熒光測量中,用對數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié) 便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點。
低壓制備色譜通常有兩種模式,一種是在柱上方加壓,另一種是在柱下方減壓。除了加減壓外,其他的與經(jīng)典柱色譜法基本一致。減壓一般是用真空泵來完成,加壓一般用空氣泵氮氣鋼瓶蠕動泵等完成。在低壓制備色譜中使用的是顆粒較大的填料,因此其分辨率是有限的?! ≈袎褐苽渖V是利用恒流泵抽送流動相,帶著樣品流經(jīng)色譜柱,實現(xiàn)對樣品的分離。中壓制備色譜系統(tǒng)由溶劑瓶、恒流泵、進樣閥、色譜柱、檢測器、記錄儀和餾分收集器等部分組成。其色譜柱一般是由耐壓的強化玻璃制成,填料顆粒大小比低壓制備色譜所用填料小,分離效率更高。