淺談流式細(xì)胞儀十大發(fā)展趨勢
從二十世紀(jì)八十年代至今,世界上生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的廠家?guī)捉?jīng)變遷,BC & BD仍在,新玩家不斷進(jìn)入,并購重組各取所需,它們生產(chǎn)各種不同性能和功能的流式細(xì)胞儀??傮w而言,呈現(xiàn)出以下的發(fā)展趨勢:
1. 應(yīng)用對象從細(xì)胞到顆粒
一般而言,流式細(xì)胞儀檢測的對象是細(xì)胞,而且是呈獨(dú)立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞,即單細(xì)胞懸液。組織和器官中的細(xì)胞,bi須用各種方法制備成單細(xì)胞懸液,才能進(jìn)行檢測。
細(xì)菌、浮游生物等也可以用流式細(xì)胞儀分析。
一些不是細(xì)胞的單個粒子,如病毒、細(xì)胞核、染色體、原生質(zhì)體等也是流式細(xì)胞儀的檢測對象。實(shí)際上,用“顆粒”而不僅僅是“細(xì)胞”來定義流式細(xì)胞儀的檢測對象,顯然更有代表意義。
因為流式細(xì)胞儀可以將“顆?!币曂瑸椤凹?xì)胞”來進(jìn)行檢測,在te制的微球上包被抗原,抗體或核酸探針,以微球為載體來檢測各種可溶性蛋白、細(xì)胞因子、自身抗體、特定的核酸序列等,從而使流式細(xì)胞儀的檢測對象擴(kuò)展到分子范圍。
Luminex公司的多重流式檢測平臺能夠自一個微量反應(yīng)孔中同時檢測50、100甚至多達(dá)500種分析物,儼然成為這一技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。
2. 檢測顆粒尺度大大拓寬
常規(guī)流式細(xì)胞儀檢測顆粒的范圍為0.5-50μm。
電荷分選流式細(xì)胞儀檢測顆粒范圍與噴嘴直徑等相關(guān),zui大應(yīng)到噴嘴直徑的1/3-1/2,目前zui大直徑的噴嘴為200μm。
Union Biometrica公司的氣流分選平臺COPAS FP和BioSorter能夠適應(yīng)大到1500μm的顆粒,可以用于分選模式動物的卵和幼蟲;模式植物種子與花粉;大體積細(xì)胞與細(xì)胞簇等。CytoBuoy公司的Cytosense也可以到1500μm?! ?/p>
Union Biometrica公司氣流分選流式原理圖
通過光路優(yōu)化,采用多角度光散射,使用特殊熒光探針,甚至加裝紫色激光收集散射光信號,有些流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)0.2μm顆粒與噪音信號的鑒別。
Apogee著力于微顆粒分析,其A50-Micro plus散射光的檢測低限至80nm,可用于循環(huán)微粒,外泌體及特殊微生物檢測。
02.jpg
Apogee A50-Micro plus
3.多種流路技術(shù)商品化
絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀基于鞘液流體動力學(xué)模式。
因為負(fù)壓進(jìn)樣省去了龐大的壓縮氣源,可以靈活使用各種上樣管,已經(jīng)成為幾乎所有公司新儀器的選擇。
一般認(rèn)為,流式細(xì)胞儀采用毛細(xì)管而非鞘液,容易被大的細(xì)胞或聚集細(xì)胞所阻塞,而且流動細(xì)胞難以準(zhǔn)確聚焦,流速難以維持恒定。
Guava平臺easyCyte(現(xiàn)被Luminex公司收購)通過負(fù)壓進(jìn)樣,采用高壓注射泵與PEEK管路,建立自穩(wěn)流的微毛細(xì)管系統(tǒng),據(jù)稱解決了以上困擾,帶來的好處是無需鞘液,產(chǎn)生廢液也少。
Guava easyCyte(Luminex)
Thermo公司聲波流式細(xì)胞儀Attune NxT ,該產(chǎn)品利用chao聲波將細(xì)胞聚集在樣品流中軸線上。進(jìn)樣速度至1mL/min時,也可以避免基于鞘液的流式的所謂軸流加寬和細(xì)胞分散現(xiàn)象,這一技術(shù)的zui大優(yōu)勢是快速檢測,同時對xi有細(xì)胞的分析比較有利。
Thermo Attune NxT
4.從相對計數(shù)到直接jue對計數(shù)
為滿足統(tǒng)計學(xué)要求,流式細(xì)胞儀必須采集一定數(shù)量的細(xì)胞,儀器設(shè)定以細(xì)胞數(shù)為停止條件。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀測試結(jié)果為相對計數(shù),即目標(biāo)細(xì)胞在某一總體系中的比值。
隨著應(yīng)用深入,人們發(fā)現(xiàn)比值的變或者不變,以及變化大小不能反映細(xì)胞的真實(shí)變化,jue對計數(shù),即單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)被證明更具實(shí)際價值。
zui早是采用雙平臺法來解決以上問題,即用血細(xì)胞分析儀來獲得白細(xì)胞,淋巴細(xì)胞等濃度,再結(jié)合流式細(xì)胞儀測定的百分比來計算被測細(xì)胞的jue對計數(shù)值。由于該法需要使用兩種儀器,操作步驟多、變異系數(shù)大,不同實(shí)驗室之間的差異也較大,因此應(yīng)用受到限制。
后來人們采用微球法,即用已知濃度的微球作為參比,通過被測細(xì)胞和微球的比例關(guān)系來進(jìn)行jue對計數(shù),但因計數(shù)微球價格較為昂貴,實(shí)際應(yīng)用受到限制。
近年來,廠家的共識回到了測定進(jìn)樣體積這一思路上來,替代微球法直接進(jìn)行jue對計數(shù),取得更為Jin確的結(jié)果。區(qū)別在于不同產(chǎn)品具體測定技術(shù)的差別。
蠕動泵:Accuri C6 Plus、CytoFlex
注射泵:easyCyte、NovoCyte、CytoFlow
流量傳感器:FACSVerse、Bricyte E6
Sysmex CytoFlow系列TVAC體積測定原理
5.光路優(yōu)化和光學(xué)新元件的應(yīng)用
龐大的水冷或氣冷的激光器逐漸被小型化的固態(tài)激光器取代。
光纖傳導(dǎo)應(yīng)用越來越普遍。
光纖耦合讓光能量傳輸更gao效,而不為公司所專有。
雪崩光電二極管等等新檢測器提供新的選擇。請見專家分析:
流式細(xì)胞儀是怎么“看見”光的?
以及光學(xué)元件的神級組合讓靈敏度達(dá)到新的高度。
MESF是儀器靈敏度衡量的標(biāo)準(zhǔn),基于微球,基于鞘液。
不同公司沒有約定俗成,不是那么容易比較,但就同一公司產(chǎn)品而言:
BD FACSCelesta FITC 25 PE 15
Beckman Coulter CytoFlex FITC 30 PE 10
6.以多色分析為核心的新型光學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展
早期流式細(xì)胞儀的主要應(yīng)用還是細(xì)胞DNA含量測定,這一技術(shù)對設(shè)備要求不高,通常配備一個散射光和一個熒光信號的流式細(xì)胞儀就足以應(yīng)付。隨著新型熒光探針的不斷開發(fā)和儀器軟、硬件的逐步更新,流式細(xì)胞儀多色熒光分析得到了迅速發(fā)展,包括兩個方面:
單激光多色,如488nm激光同時激發(fā)7色,紫色激光同時激發(fā)10色
多激光:如10激光機(jī)器。
也包括兩種新的光學(xué)設(shè)計機(jī)型:
光譜流式,利用特殊的接受裝置收集某范圍內(nèi)的全發(fā)射光譜,無需補(bǔ)償,區(qū)別發(fā)射光譜重合度高的熒光染料對。目前有Sony公司SP6800Z和SA3800,Cytek公司的Aurora。
質(zhì)譜流式,利用質(zhì)譜原理對單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測的流式技術(shù)。這個名為CyTOF的平臺ui初由DVS Sciences公司開發(fā),后被Fluidigm公司收購。儀器采用同位素標(biāo)記抗體來標(biāo)記或識別細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子,并根據(jù)流式細(xì)胞原理分離單個細(xì)胞,再用感應(yīng)耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)觀察單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜,zui后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)。2015年推出的Helios的檢測通道達(dá)到135個,幾乎沒有信號重疊或背景噪音。