流式細(xì)胞儀調(diào)試和使用
簡介
古語說:“工欲善其事,必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細(xì)胞分析和分選技術(shù),必需先對儀器進(jìn)行調(diào)試,使其處于良好的工作狀態(tài),并能正確使用儀器。下面簡要介紹細(xì)胞計的調(diào)試項目及要點、使用的程序等等。
調(diào)試和校準(zhǔn)
流式細(xì)胞儀在使用前,甚至在使用過程中都要精心進(jìn)行調(diào)試,以保證工作的可靠性和佳性。調(diào)試的項目主要是激光強(qiáng)度、液流速度和測量區(qū)的光路等。
激光強(qiáng)度:除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外,還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強(qiáng)度輸出為大。
液流速度:可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督,調(diào)節(jié) 氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。
測量區(qū)光路調(diào)節(jié) :這是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90散射測量光電系統(tǒng)垂直正交,而且交點較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。
流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量是相對值,因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定,這樣才能通過相對測量獲得的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能:儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定,有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形,樣品分散性能良好,且經(jīng)濟(jì)、容易獲得。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品,雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。微球用樹脂材料制作,或標(biāo)有熒光素,或不標(biāo)記熒光素。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過程昭下:取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血(抗凝劑:雞血=1:4),經(jīng)PBS清洗3次,再用5~10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合,室溫下振蕩醛化24h,經(jīng)PBS再清洗,貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色,所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。
儀器的操作和使用
①打開電源,對系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱;
②打開氣體閾,調(diào)節(jié) 壓力,獲得適宜的液流速度;開啟光源冷卻系統(tǒng);
③在樣品管中加入去離子水,沖洗液流的噴嘴系統(tǒng);
④利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品,調(diào)整儀器,使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上,0和90散射的熒光強(qiáng)度強(qiáng),并要求變異系數(shù)為?。?/p>
⑤選定流速、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等,在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品;同時選擇計算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式,從而能直觀掌握測量進(jìn)程;
⑥樣品測量完畢后,再用去離子水沖洗液流系統(tǒng);
⑦因為實驗數(shù)據(jù)已存入計算機(jī)硬盤(有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng),存貯量更大),因此可關(guān)閉氣體、測量裝置,而單獨使用計算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;
⑧將所需結(jié)果打印出來。
操作和使用中的注意事項
1)光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件,暴露的較強(qiáng)的光線下以后,需要較長時間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作;另外還要注意磁屏蔽;
2)光源不得在短時間內(nèi)(一般要1h左右)關(guān)上又打開;使用光源預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常;
3)液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通,避免氣泡栓塞,所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒;
4)注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等;
5)特別強(qiáng)調(diào)每次測量都需要對照組。